体外転写（IVT）反応の基礎と当社精製プロセスの特長

in vitro転写（IVT）mRNAは、従来の用途においてプラスミドDNAの代替として使用できる代替的遺伝子材料である。合成mRNAのIVT方法の開発により、新たな種類の遺伝子治療の増加が見られる。

合成mRNAは長鎖一本鎖RNA分子で構成され、バクテリオファージRNAポリメラーゼ（T7、SP6、T3）を用いてDNAテンプレートのin vitro転写により生産できる。in vitro転写のDNAテンプレートには、バクテリオファージプロモーター、翻訳不能領域（UTR）、開読フレーム（ORF）、およびpoly(T)配列が必要である。さらに、IVT反応溶液には4種類のリボヌクレオシド三リン酸（rNTPs）、RNAポリメラーゼ、およびDNAテンプレートが含まれる。

合成後のIVT mRNAは、天然の真核生物mRNAと同様に標的タンパク質の発現を調節する単鎖RNA分子を含む。IVT反応後、純化ステップは重要であり、不必要な免疫反応を引き起こす可能性のある残留分子を除去する。IVT mRNAは市販のmRNA純化キットまたはイソプロパノール沈殿で純化できる。大規模な純化には、液体クロマトグラフィー法が一般的に用いられる。

初期レビュー後、我々はmRNA生産におけるIVTをさらに検討した。以下が我々の調査結果の概要である:

• 以前の研究で先天性免疫反応を引き起こしたIVT mRNAに対応して、Ψ（プセウドウリジン）などの化学修飾が開発されている。

• 単鎖合成mRNAの末端にある5'キャップは、エキソヌクレアーゼから保護し、真核翻訳開始因子4Eとの結合により翻訳の開始を促進する。

• 鎖のもう一方の端（3'）には、ポリA結合タンパク質（PABP）と結合した翻訳開始ステップに関与するポリAテールがあり、このテールの長さは安定性に大きな影響を与える。

• IVT後、DNaseがオリジナルのDNAテンプレートを分解し、5'三リン酸塩基群は熱不安定性の南極リン酸アミラーゼで除去される。この三リン酸塩基群の除去は、潜在的な免疫反応を低減する。

• 合成mRNAの純化には、ほとんどの市販純化キットは、多ヌクレオチドを膜またはビーズに選択的に結合させる基盤（例：当社のOdT機能化膜）に基づいている。

• さらに、サイズ排他法またはイオン交換法を用いたHPLCは純化に利用可能だが、最も効率的ではなく、スケールアップが困難である。

• 未精製mRNAは相対的に低い翻訳効率と高レベルのサイトカイン分泌1をもたらすため、純化はこのプロセスの重要なステップである。

• 標準化されたIVTプロセスが存在しないため、mRNA生産分野における主要な課題となっており、単一のmRNA純化プラットフォームの開発を制限している。

• mRNAは大きな不安定性分子であり、ストレスと酵素分解に敏感であるため、繊細な生産プロセスを必要とする。